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ISSN : 1225-4517(Print)
ISSN : 2287-3503(Online)
Journal of Environmental Science International Vol.27 No.11 pp.999-1005
DOI : https://doi.org/10.5322/JESI.2018.27.11.999

Effects of Antarctic Ocean Krill Meal with NaF Oral Administration on Serum and Tissues in Rats

Dong-Soo Kang, Dong-Hyeok Jin1), Da-Young Oh1), Young-Geun Lee1), Han-Soo Kim1)*
Department of Food Science and Technology, Pusan National University, Miryang 50463, Korea
1)Department of Marine Bio Food Science, Chonnam National University, Yeosu 59626, Korea
*Corresponding author: Han-Soo Kim, Department of Food Science and Technology, Pusan National University, Miryang 50463, Korea Phone : +82-55-350-5351
03/07/2018 27/08/2018 06/09/2018

Abstract


The purpose of this study was to probe the influences of krill (Euphausia superba) meal with NaF oral administration on a dose-effect relationship between fluoride levels of krill meal and serum enzyme activity such as alkaline phosphatase (ALP), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), and lactate dehydrogenase (LDH) in rats fed experimental diets for 5 weeks. There were no significant decreases in the activities of ALP, AST, ALT, and LDH in sera among krill meal diet groups (KF10, KF20, KF30). However, these groups were significantly (p<0.05) lower enzyme activities than normal diet (ND) plus NaF 10 mg group (NF). The fluoride levels of serum and organ tissues (liver, brain, heart, lung, kidney) in NaF 10 mg groups (NF, KF10, KF20, KF30) were significantly increased by adding krill meal in comparison with normal diet group. The results indicate that a difficult to found toxicity to the tissues from krill meal diet groups.



남극해 크릴 분말과 NaF 처리가 흰쥐의 혈청 및 조직에 미치는 영향

강동수, 진동혁1), 오다영1), 이영근1), 김한수1)*
전남대학교 해양바이오식품학과, 1)부산대학교 식품공학과

    1. 서 론

    남극해에 서식하는 krill (Euphausia superba)은 난 바다곤쟁이목에 속하는 갑각류로 남극해의 생태계를 유 지하는데 중요한 역할을 하고 있으며, 어획량이 풍부하 며 양질의 지질과 단백질 함량이 높고 그 중 인지질, DHA (docosahexaenoic acid), EPA (eicosapentaenoic acid)와 같은 오메가-3 지방산 및 필수 아미노산이 다량 함유되어 식품 및 가공품으로의 활용도가 높아 미래 식 량자원으로 주목받고 있다(Clarke, 1980; Schuchardt et al., 2011;Kim et al., 2014). 영양학적 가치가 우수함에 도 어획 후 가공, 변색 등의 이유로 아직 국내 식품에 활 용하지 못하고 있으며, 그 중 갑각에 내포된 높은 불소함 량이 가장 큰 원인으로 알려져 있다(Yoshitomi et al., 2007), 불소화합물은 주로 플루오르화소듐(NaF), 모노 플루오르인산소듐(Na2PO3F), 플루오르화주석(II)(SnF2) 형태로 식품 가공, 치약, 구강 청결제, 음식, 음료의 형태 로 일상에 사용되는데, 적절한 양(0.8~1.2 ppm)일 때는 충치예방과 변색방지 등의 장점이 있지만 매일 일정량 이상 장기간 섭취한다면 신경조직에 독성 효과를 뇌 발 달에 영향을 주며(Mittal and Flora, 2006), 간, 신장, 척 수 등의 동물과 인간의 기관, 주로 골격 시스템에 많은 손 상을 야기한다고 보고되어 있다(Dote at al., 2000; Wang et al., 2004). 또한 불소와 골경화증, 호흡기 질환 사이의 관계가 아직 명확히 규명 되지 않았다는 것으로 보고되어 있다(US Public Health Service, 1991;Mullenix et al., 1995). 또한 일정 이상 농도의 불소에 장기간 노출되었을 때 체내의 여러 산화적 스트레스를 유발하여 혈중 포화/불포화지방산 비율 증가 및 테스토 스테론의 농도를 감소시키고 간장과 신장, 남성 생식 기 관에 악영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Wang et al., 2000;Ghosh et al., 2002;Xiong et al., 2007). 이에 국 내외 krill 내 불소 제거에 관한 연구(Rhee and Kim, 1999)와 기능성(Kim et al., 2000), 독성(Berge et al., 2000), 안정성(Robertson et al., 2014) 등 krill의 식용 화를 위한 연구와 노력이 계속되고 있다. 따라서 본 연구 는 krill meal의 NaF 함량 및 NaF 10 mg을 경구 투여한 krill meal 첨가 식이 흰쥐의 장기에서 축적된 NaF 함량 등을 조사하여 혈청 효소활성에 미치는 영향을 알아보았 다.

    2. 재료 및 방법

    2.1. 실험재료

    본 실험에 사용된 krill meal은 국립수산과학원으로부 터 동결건조시킨 후 처리된 것을 제공받아 사용하였다.

    2.2. 실험 동물

    평균 체중 200±10 g인 7주령된 Sprague Dawley 계 수컷 흰쥐(DAEHAN BIOLINK Co., LTD, Chungcheongbukdo, Korea)를 7% 콩기름(Ottogi, soybean oil, Gyonggido, Korea)을 함유하는 기초식이 로 1주일간 예비 사육하여 적응시킨 후 난괴법 (randomized complete block design)에 의해 6마리씩 5 군으로 metabolic cage (JD-C-71, Jeongdo, Korea)에 나누어 5주간 실험 사육하였다. 실험 사육실의 온도 20±1℃ 및 습도 50±10%는 일정하게 유지시켰고, 명암 은 12시간(7:00~19:00) 주기로 조명하였다(Kim et al., 2014). 예비사육 및 실험사육 등 동물실험은 부산대학교 동물윤리위원회의 승인(PNU-2012-0004)과 관리 감독 하에 실시되었다.

    2.3. 식이조성 및 실험군

    식이조성 및 실험군은 Table 1과 같다. 기본 식이를 섭취시킨 대조군(control)인 ND군, 기본식이에 NaF 10 mg씩 경구 투여한 NF군과 10%, 20%, 30% krill meal 첨가 식이에 NaF 10 mg씩 경구 투여한 KF10군, KF20 군, KF30군으로 나누었다.

    2.4. 실험 동물의 처리

    실험 사육 최종일에 7시간 동안 절식시키고 에테르 마 취하에 심장채혈법으로 혈액을 취하여 4℃ 에서 1시간 방치한 후 분당 3,000 cycle로 20분간 원심분리하여 혈 청 및 간장, 뇌, 심장, 폐, 및 신장 등의 각 조직을 얻어 실 험에 사용하였다(Kim et al., 2014).

    2.5. 혈청 중 효소활성의 측정

    2.5.1. Alkaline phosphatase (ALP) activitiy 측정

    혈청 중 alkaline phosphatase (ALP, EC 3.1.3.1) 활 성은 혈청 ALP측정용 kit 시약(NEW-K-PHOS, Eiken, Tokyo, Japan)을 이용하여 생화학분석기(Hitachi 7150, Tokyo, Japan)로 측정하였으며, 혈청 1.0 mL당 unit으 로 표시하였다.

    2.5.2. Aminotransferase (AST, ALT) activity 측정

    Aspartate aminotransferase (AST, EC 2.6.1.1)와 alanine aminotransferase (ALT, EC 2.6.1.2)는 효소법 에 의해 조제된 시약(혈청 transaminase 측정시약, Eiken, Tokyo, Japan)을 사용하여 혈청 중 AST 및 ALT활성을 측정하였으며, 혈청 1.0 mL당 unit으로 표 시하였다.

    2.5.3. Lactate dehydrogenase (LDH) activity 측정

    Lactate dehydrogenase (LDH, EC 1.1.1.27)는 효소 법에 의해 조제된 kit시약(Eiken, Tokyo, Japan)을 사용 하여 생화학분석기(Hitachi 7150, Tokyo, Japan)로 측 정하였다(Kim, 2006).

    2.6. 불소 함량 측정

    총 불소 함량은 Singer and Ophaug(1979)의 방법에 준하여 측정하였다. 시료를 nickel 도가니에 칭량한 다 음, 0.5 M의 NaOH 용액을 2.0 mL 주입하여 혼합한 후 도가니를 hot plate 위에 놓고 증발, 건조시킨 후 550℃ 에서 5시간 동안 연소시켰다. 도가니를 냉각한 다음, 증 류수 7.0 mL 가하여 시료 용액을 15.0 mL conical tube 에 옮기고 pH를 1.2 mol HCl 용액으로 pH 7.5까지 조 절한 후 10.0 mL에 정용하였다. 이 중 2.0 mL를 취하여 TISAB Ⅲ (Total Ionic Strenght Adjust Buffer Ⅲ) 용 액 0.2 mL 가한 후 완전히 혼합하여 불소이온전극(9609 BNWP and 960900 fluoride combination electrode, Thermo Scientific, U.S.A.)을 pH/mv 메타(Orion dual star, pH/ISE benchtop, Thermo Scientific, U.S.A.)와 연결하여 측정하였다. 시료의 불소 함량은 불소 이온의 sodium fluoride 표준검량곡선에 의하여 정량하였다.

    2.7. 통계 처리

    분석 결과의 통계처리는 실험군 당 평균치의 표준편 차를 계산하였고, 군간의 유의적인 차이는 one-way ANOVA로 분석 한 뒤 p<0.05 수준에서 Duncan`s multiple range test에 의하여 각 실험군 간의 유의성을 검증하였다. 통계처리에 대한 프로그램은 IBM SPSS statistic ver. 22를 사용하였다.

    3. 결과 및 고찰

    3.1. Alkaline phosphatase (ALP) 활성

    실험에 사용된 흰쥐 혈청에서의 alkaline phosphatase (ALP, EC 3.1.3.1) 활성은 Fig. 1과 같다. 기본식이에 NaF 10 mg 경구 투여한 NF군의 ALP 활성은 30.6±0.8 unit/mL로 다른 군에 비해 유의적으로 높게 나타났으며 (p<0.05), KF20군 29.1±0.5 unit/mL, KF10군 28.8± 0.6 unit/mL, ND군 27.8±1.1 unit/mL, KF30군 27.5± 0.7 unit/mL 순으로 관찰되어, Krill meal 식이군에서 KF10군과 KF20군간의 krill meal 함량에 따른 유의적 차이는 관찰되지 않았으나 NaF 10 mg 경구 투여와 30% krill meal 식이를 급여한 KF30군에서 유의적으로 가장 낮은 ALP 활성이 관찰되었다(p<0.05). ALP는 간 세포의 담관에 존재하는 효소로서 골절, 성장 등의 이유 로 조골세포(osteoblast)를 합성할 때 중요한 역할을 하 며(Anderson et al., 2004;Eune et al., 2005), 주로 이 상지질혈증 및 담즙산 배설 장애 등에 의해 간 손상이 일 어났을 경우 그 수치가 증가하여 만성 감염, 간경변, 면역 성 간염 등의 간검사 지표로 사용 된다고 알려져 있다 (Kaplan and Righetti, 1970;Ooi et al., 2007).

    3.2. Aminotransferase (AST, ALT) activity

    흰쥐 혈청 중의 aspartate aminotransferase (AST, EC 2.6.1.1) 및 alanine aminotransferase (ALT, EC 2.6.1.2) 활성은 Fig. 2에 나타내었다. ND군과 NF군, krill meal 식이군(KF10, KF20, KF30)에서의 AST 및 ALT 활성은 같은 경향으로 나타났으며 NF군의 AST 및 ALT 활성은 72.8±1.5 unit/mL, 26.9±1.1 unit/mL으 로 다른 군에 비해 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05). 또한, ND군의 AST 및 ALT 활성은 68.5±1.9 unit/mL, 23.8±1.2 unit/mL, KF10군은 68.5±1.2 unit/mL, 24.1 ±1.1 unit/mL, KF20군 69.5±1.2 unit/mL, 24.3±1.2 unit/mL로 나타났다. KF30군은 65.9±1.3 unit/mL, 22.8±1.2 unit/mL로 가장 낮은 수치가 관찰되었으며, AST 활성은 KF30군이 KF20군에 비해 유의적으로 낮 은 결과로 나타났으나 ALT 활성에서는 ND군과 krill meal 식이군 사이의 유의적 차이는 없는 것으로 나타났 다(p<0.05). AST 및 ALT는 간, 심장, 신장, 뇌 등에 존 재하는 효소로 주로 알코올성 간염, 지방간, 간 세포 손상 에 의해 활성이 증가하며(Kim et al., 2004), 이는 체질 량 지수, 허리 둘레, triglyceride, 낮은 HDL (High Density Lipoprotein) cholesterol, 고혈압, 2형 당뇨와 같은 비만 및 대사 증후군과도 관련이 있다고 알려져 있 다(Clark et al., 2003).

    3.3. Lactate dehydrogenase (LDH) activity

    흰쥐 혈청 중 lactate dehydrogenase (LDH, EC 1.1.1.27) 활성은 Fig. 3에 나타내었다. NF군에서의 LDH 활성은 975.8±20.4 unit/mL으로 다른 군에 비해 유의적으로 높게 관찰 되었으며(p<0.05), KF10군 957.8±18.8 unit/mL, KF20군 935.8±17.6 unit/mL, ND군 934.2±18.2 unit/mL, KF30군 923.7±19.5 unit/mL로 대조군 및 krill meal 첨가 식이군 사이에서 의 유의적인 차이는 없는 것으로 관찰되었지만 그 중 KF30군에서 LDH 활성이 가장 낮은 것으로 나타났다 (p<0.05). LDH는 세포 조직에 분포되어 있으며 pyruvic acid와 lactic acid 간의 가역적 반응에 관여하는 것으로 알려져 있다(Joo and Lim, 2009). 또한 종양세포, 간세 포와 같이 LDH를 내포한 조직이 파괴될 때 LDH를 혈 액 중으로 방출하여 세포독성 및 Tumor Necrosis Factor (TNF)의 활성에 LDH 수치가 이용되는 것으로 알려져 있다(Decker and Lohmann-Matthes, 1988). 혈 청 ALP, AST, ALT 및 LDH 등은 간 손상 지표로 사용 되며(Wu et al., 2004), 혈액에서의 질소 산화물 저항, 지 속발기증, 다리 궤양, 폐 고혈압, 겸상 적혈구 빈혈의 바 이오 마커로 사용될 수 있다고 보고되고 있다(Kato et al., 2006).

    3.4. Krill meal, 혈청 및 장기조직의 불소 함량

    불소 함량 계산에 사용된 검량선은 Fig. 4에 표시하였 으며(Jin et al., 2018), 식이 조제에 사용된 krill meal의 불소 함량은 1,262.40±10.53 μg F-/g이었고(Jin et al., 2018), 흰쥐의 혈청 및 장기조직의 불소 함량은 Table 2 에 나타내었다. 기본식이를 급여한 ND군은 혈청 및 간 장, 뇌, 심장, 폐, 신장에서 다른 군에 비해 유의적으로 가 장 낮은 결과가 나타났으며(p<0.05), NF군 및 krill meal 의 함량을 달리한 급여군에서의 불소 함량은 혈청 및 각 조직 중 뇌 조직의 불소 함량이 가장 높았고, 폐와 신장에 서 높은 불소 함량이 관찰되었다. 또한, 혈청 및 각 조직 에 있어서 불소함량은 krill meal 함량에 따라 유의적으 로 증가하는 경향이 관찰되었다(p<0.05). 이는 krill meal 섭취 시 혈청 및 장기 조직에 불소가 축적되는 정도 차이에 의해 이와 같은 결과가 나타난 것으로 사료된다. Kim et al.(2013)의 krill 불소 추출물의 간세포 독성 및 산화적 스트레스에 대한 연구에서 krill 불소 추출물은 산화적 스트레스에 영향을 주지 않으며 독성이 나타나지 않은 것으로 보고하였다.

    4. 결 론

    7주령된 Sprague Dawley계 수컷 흰쥐에게 5주간의 NaF 10 mg 경구 투여 및 krill meal 첨가 식이 급여가 혈청 효소활성과 혈청 및 장기조직의 불소 함량에 미치 는 영향을 관찰하기 위하여 본 실험을 실시하였다. 기본 식이를 급여한 대조군인 ND군과 NaF 10 mg 경구 투여 처리에 기본식이를 급여한 NF군, krill meal 첨가 급여 군인 KF10군(krill meal 10%), KF20군(krill meal 20%), KF30군(krill meal 30%) 5가지 군으로 나누어 사육하였으며, 혈청 중 alkaline phosphatase (ALP), aminotransferase (AST, ALT) 및 lactate dehydrogenase (LDH)의 효소 활성은 NF군 보다 krill meal 첨가 군에 서 감소하였으며 대조군인 ND군보다 약간 높거나 유의 적인 차이가 없는 것으로 나타났다(p<0.05). 흰쥐의 혈 청 및 장기조직의 불소 함량은 krill meal의 함량에 따라 불소함량도 함께 증가하는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과들을 미루어 볼 때, krill meal 첨가 식이가 흰쥐의 혈청 및 장기조직에 불소를 축적하는 것으로 나타났지만 ALP, AST, ALT, LDH 효소활성을 감소시키는 것으로 보아 krill meal에 함유된 비타민 및 아미노산과 같은 다 른 생리활성물질들의 작용에 의해 이러한 영향을 주는 것으로 사료된다.

    Figure

    JESI-27-999_F1.gif

    Effects of krill (Euphausia superba) meal on alkaline phosphatase (ALP, EC 3.1.3.1) activities in serum of experimental rats.

    1)The values are means±standard deviation (n=6). Bars with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan`s multiple range tests.

    JESI-27-999_F2.gif

    Effects of krill (Euphausia superba) meal on aspartate and alanine aminotransferase (AST, EC 2.6.1.1 ; ALT, EC 2.6.1.2) activities in serum of experimental rats.

    1)The values are means±standard deviation (n=6). Bars with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan`s multiple range tests.

    JESI-27-999_F3.gif

    Effects of krill (Euphausia superba) meal on lactate dehydrogenase activity in serum of rats fed the experimental diets for 5 weeks.

    1)The values are means±standard deviation (n=6). Bars with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan`s multiple range tests.

    JESI-27-999_F4.gif

    Standard curve of fluoride standard solution.

    Table

    Compositions of experimental diet and groups (%)

    Determination of fluoride (F) contents in serum and tissue of the rats fed experimental diet for 5 weeks

    Reference

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