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ISSN : 1225-4517(Print)
ISSN : 2287-3503(Online)
Journal of Environmental Science International Vol.28 No.3 pp.385-392
DOI : https://doi.org/10.5322/JESI.2019.28.3.385

Control Effect of Fusarium Wilt of Cucumber by Trichoderma Collection Strain

Youn Jin Park, Young Su Lee1), Seoung-Won Ann2), Yong-Koo Cho3), Hyung-Won Lee4), Myoung-Jun Jang3)*
Green Manure and Legumes Resource Center, Kongju National University, Yesan 32439, Korea
1)Enviromental Agriculture Research Division, GARES, Hwaseong 18388, Korea
2)Department of Horticultural Science, Kongju National University, Yesan 32439, Korea
3)Department of Plant Resources, Kongju National University, Yesan 32439, Korea
4)Union Bio Co., Daejeon 34068, Korea
Corresponding author: Myoung-Jun Jang, Department of plant Resources, Kongju National University, Yesan 32439, Korea Phone:+82-41-330-1204 E-mail: Plant119@kongju.ac.kr
20/02/2019 12/03/2019 14/03/2019

Abstract


This study investigated the relationship among seven species of trichoderma through the identification of strains collected in Korea. The phylogenetic tree among the collected strains was classified into four groups. The trichoderma strains isolated in this way showed inhibitory effect on the fusarium wilt which is parasitic to cotyledon stem..The invisibility of J9, J10, J13 and J16 strains were higher in comparison with other strains in vitro test stand, and their spore production level was also higher. In the aluminum ring tests, it showed that the yield of the spores in J9, J10 and J13 were more than any other strain. As a result conducting the port test for cucumbers, the plant lengths of J13 were larger than the control plot, and the root lengths of all strains, except for J2 were longer than the control plot, and the root weights of J1, J9, J10, J13 and J16 were larger than the control plot. The disease severity for the fusarium wilt showed the smallest values at J13 and J16 in comparison with the control plot, and the control values of J13 and J16 were higher than other strains.



Trichoderma 수집균주별 오이 덩굴쪼김병 방제효과

박 윤진, 이 영수1), 안 승원2), 조 용구3), 이 형원4), 장 명준3)*
공주대학교 두과녹비자원연구센터
1)경기도농업기술원
2)공주대학교 원예학과
3)공주대학교 식물자원학과
4)유니온바이오

    1. 서 론

    Trichoderma 속은 토양 생태계에 존재하고, 특히 식물 뿌리에서 자주 발견되는 토양곰팡이에 속한다(Harman et al., 2004). 이러한 tricoderma와 같은 곰팡이류는 비 병원성으로 식물의 근권에 기생하는 특성이 있으며 식물 병원균의 균사체에 기생하거나 식물의 체내 방어기작을 활 성화시키는 것으로 알려져 있다(Francesco et al., 2008). 또한 식물생장촉진균(plant growth promoting Fungi) 으로 뿌리표면에 균체를 형성(colonization)며, 식물 체내 물질대사에 영향을 준다는 보고들이 있다(Harman et al., 2004). 이러한 식물근권내에 기생하는 곰팡이류중 trichoderma 균들은 식물의 성장을 촉진시키고, 이용 가 능한 영양분의 흡수를 증가시켜 작물의 생산량을 향상시 키고 식물 병에 대한 저항성을 강화시키는 것으로 알려 져 있다(Harman et al., 2004). 또한 tricoderma 균류는 섬유소분해 효소 등을 생성하며 키틴분해효소(chitinase), 글루칸분해효소(glucanase) 등은 식물병원균의 세포벽 분해 효소를 분비한다는 보고들이 있다(Mckeen et al., 1986;Monoghan and Tkacz, 1990;Inbar and Chet, 1995;Haran, et al., 1996; Harman et al., 1996).

    Fusarium속 균들은 토양에 존재하는 곰팡이류 중 환 경적응성이 높아 여러 식물의 도관부에 침입하여 식물체 를 고사시키는 식물병원균(Ploetz et al., 1996)으로써 Fusarium은 특정 작물에서만 병원성을 나타내는 기주 특성이 있다(Hubbard and Gerik, 1993;Garibaldi et al., 2002). 그중 F. oxysporum은 그 기주에 따라 약 70 여종의 분화형으로 구분되어 진다(Armstrong and Armstrong, 1981).

    작물 시설 재배시 시설내 습도가 높고 광투과량이 적 어 지상부의 병해발생이 조장되며 동일한 토양내 연속재 배시 토양전염성 병해 발생이 시설재배시 큰 문제로 대 두되어있다. Lee et al.(2004)등은 고구마의 Fusarium wilt는 토양 수분이 적을수록 병 발생이 높다고 하였고, Yang et al.(2000)은 과채류에 발생하는 Fusarium 병해 는 하우스 내 토양 염농도(EC)와 인산 함량이 높을수록 발병이 높으며 특히 오이의 경우에 저항성대목을 이용하 고는 있지만 연작 등에 의해 Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum이 발병하여 생산량에 영향을 미친다.

    따라서 본 연구에서는 국내에서 수집된 trichoderma 균주들간의 Fusarium wilt에 대한 방제효과를 검정하여 토양내 연속재배시 연작장애를 해결하는데 기초연구를 삼기 위하여 수행하게 되었다.

    2. 재료 및 방법

    2.1. 시험균주의 분리 및 Trichoderma의 배양

    오이 Fusarium wilt의 병원균은 경기도 화성에 위치한 경기도농업기술원 시험포장에서 수집하였다. 채집한 시 들음 증상의 오이로부터 유관속 부위가 갈변된 줄기를 5 mm내외로 잘라서 1% 차아염소산나트륨(NaOCl)용액 에서 1분간 표면 살균하였다. 살균수로 3회 세척 후 물 기를 제거하고, 감자한천배지(PDA, Potato Dextrose Agar, Difco)에 치상하였다. incubator 25°C 에서 3일간 배양한 균사의 선단부위를 직경 5 mm 코르크보러를 이 용하여 PDA배지에 옮겨 배양하면서 시험균주로 사용하 였다.

    Trichoderma는 경기도농업기술원에서 보유 중인 균 주를 사용하였다. 사용된 균주 Table 1과 같다. 모두 7균 주로서 J1, J2, J9, J10, J13, J16, J17이었고, 28°C 에서 3 일간 PDA배지에 배양하여 사용하였으며, 광학현미경 (Carl Zeiss, AX10)으로 균사의 특성을 조사하였다.

    2.2. 시험균주의 동정 및 Trichoderma 유사성 비교

    모든 균주는 ribosomal DNA-ITS 부위의 염기서열 분석을 통해 동정을 실시하였다. potato dextrose broth 배지에서 7일 배양된 trichoderma를 2 mL의 microtube에 넣고, 24시간 동결건조 시킨 후 균사를 고르게 분쇄하여 QIAGEN DNeasy Plant Maxi Kit를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다(Druzhinina et al., 2005). ITS 부위의 증폭을 위해 프라이머 SR6R (5'-AAG TAT AAG TCG TAA CAA GG-3')와 LR1 (5'-GGT TGG TTT CTT TCC T-3')을 사용하였다. PCR 반응조건은 94°C 에서 1분 동안 predenaturation 시킨 후에 94°C 에 서 1분 denaturation, 50°C 에서 1분, 74°C 에서 1분 30초 간 extension을 30번 반복 반응한 후에 74°C 에서 7분간 extension하여 4°C 에서 보관하여 ITS 유전자 염기서열 분석시료로 사용하였다. 이 분석시료는 1.5% agarose gel에 전기영동을 한 후 ethidium bromide로 염색하여 확인하였으며, marker로는 100 bp DNA ladder를 사용 하였다. 그 후 PROMEGA PCR Clean-up system kit를 사용하여 정제한 후 sequencing을 하고, National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BLAST 검색을 통해 종을 동정 하였으며, MEGA5 프 로그램의 clustalW 모듈을 이용하여 균주간의 유사성을 조사하였다.

    2.3. 길항력 조사

    균사생장억제 효과는 대치배양(Dual culture)과 시 험관테스트를 하였고, Jun and Kim(2004)이 보고한 알루미늄링 테스트도 수행하였다. 대치배양은 7종의 trichoderma를 각각 PDA배지에 한쪽에 옮기고, 다른 한쪽은 Fusarium wilt를 각각 치상하여 10일 후 길항력 을 조사하였다.

    시험관 테스트는 양쪽에 구멍이 있는 20×200 mm 의 시험관을 사용하였다. 바로커상토 80%, 톱밥 16%, 미강 4%를 혼합하여 시험관에 충진 한 후 121°C 에서 40분간 살균한 다음 냉각하여 시험균주를 접종하였다. 한 방향 에 Fusarium wilt원균을 접종하고, 반대편에 수집균 trichoderma 9종을 각각 접종하여 배양온도 25°C 에서 균주간의 대치양상을 조사하였다.

    알루미늄링법은 지름 3 cm이고 폭이 0.8 cm인 알루 미늄 링을 이용하는 것으로서 알루미늄링 바닥을 알루미 늄 호일로 감싼 후 121°C 에서 20분간 살균한다. 이후 PDA배지를 제조한 후 굳기 전에 알루미늄 링에 넣어 넘 치지 않게 충진 한다. 배지가 굳은 후 Fusarium wilt를 접 종한 후 25°C 에서 2일간 배양한 다음 다른 면에 trichoderma를 접종하여 25°C 에서 3일간 배양을 실시한 다음 trichoderma의 생장특성을 조사하였다.

    2.4. 오이 덩굴쪼김병에 대한 방제효과 검정

    오이(품종명 : Baekchim dadagi)는 50공 연결포트에 원예용 상토(바로커)를 넣고 파종하여 8일간 재배한 유 묘를 사용하였다. PDA에서 생장한 trichoderma 7종과 Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum의 표면을 scraper로 모아 증류수에 넣고 Hemocytometer을 이용 하여 포자현탁액 (107 spores/mL)을 만들어 사용하였다. 오이의 유묘는 뿌리를 절단 한 후 Fusarium 현탁액에 30 분간 담근 후 지름 12 cm 포트묘에 정식한 후 다음날 7 종의 trichoderma를 각각 50 mL씩 접종한 후 3일 간격 으로 4회 추가 접종하였으며, 처리구 당 10주의 오이를 사용하였으며, 3회 반복실험 하였다. 총 생육기간은 24 일로 생육 및 발병특성을 조사하였으며, 발병도는 0 = 무 병징, 1 = 하엽황화, 2 = 상하엽 황화, 3 = 상하엽 황화 및 시듦, 4 = 고사의 4단계(Kim, 2010)로 구분하여 조사 하였다.

    3. 결과 및 고찰

    곰팡이의 유연관계를 조사하기 위해 유용하게 사용되 는 Internal Transcribed Spacer (ITS)가 있으며, ITS1 과 ITS2의 염기서열 분석은 다른 곰팡이 중에서 Hypocrea와 Trichoderma에 관한 1,500개 이상의 종을 확인하기 위해 10년 이상 사용되었다(Druzhinina et al., 2005).

    이러한 방법으로 국내에서 수집한 trichoderma 7종에 대하여 유연관계를 조사한 결과 크게 4개의 그룹으로 나 타났다(Fig 1).

    수집균주별로 후막포자가 생성되는 것을 확인하였다 (Fig 2). trichoderma의 후막포자는 미생물제제의 유효 성분으로 사용되어 왔으며(Harman et al., 1991;Jin et al., 1991;Eyal et al., 1997), 본 실험에 사용된 모든 균 주들도 최종 결과에 따라 미생물제제 개발에 유용할 수 있을 것으로 판단되었다.

    대치배양 결과 모든 trichoderma종들이 Fusarium wilt에 대하여 억제하는 효과를 보였으며 10일 후에는 녹색의 포자가 병원균 쪽으로 덮으며 자라는 것도 조사 되었다(Fig 3). Yang et al.(2013)에 의하면 여러 식물병 원균에 대하여 25%가량 균사생장을 저해한다고 하였으 며, 그 중 고추 역병균에 대하여도 50% 이상의 균주가 균사생장 저해활성을 보인다고 하였는바 본 실험에서도 Fusarium wilt에 대하여 trichoderma균주들이 모두 균 사생장 저해활성을 나타내어 이와 유사한 경향이었다.

    Tokimoto et al.(1994)의 방법을 응용하여 양쪽이 뚫린 시험관에 배지를 충전한 후 한쪽에는 trichoderma, 다른 한쪽에는 Fusarium wilt를 접종하여 15일 후 조사한 결 과 Fig 4와 같다. 다른 균주들에 비해 J9, J10, J13, J16 균주들의 침입력이 높았고, 포자생성량도 많았다. 또한 15일 후 Fusarium이 접종되었던 부위를 조사한 결과 J9, J13, J16의 포자가 Fusarium의 위에 생성되는 것을 확인 할 수 있었다.

    Fusarium의 독소생성에 따른 trichoderma의 생장정 도를 조사한 결과 J9, J10, J13에서 포자의 생성량이 다 른 균주 보다 많은 것으로 나타났다(Fig 5). Jun and Kim(2004)에 의하면 Pythium spp에 trichoderma 균주 들이 균사생장을 억제한다고 하였으며, 본 실험의 Fusarium에서도 생장억제효과를 확인할 수 있었다.

    오이에 대한 포트검정을 실시한 결과 Table 2와 같다. 초장은 J13에서 대조구 보다 크게 나타났고, 근장은 J2 를 제외한 모든 균주에서 대조구 보다 길었으며, 근중은 J1, J9, J10, J13, J16이 대조 보다 많았다(Fig 6). Fusarium wilt에 대한 발병도는 대조구 대비 J13과 J16 에서 가장 작았으며, 방제가는 J13과 J16에서 다른 균주 들에 비해 높게 나타났다.

    이상과 같은 결과 J13과 J16이 Fusarium wilt에 대한 방제효과가 우수한 것으로 판단되었고, 농업현장에서의 활용을 위해 제제화에 대한 추가적인 연구가 필요하다고 사료된다.

    4. 결 론

    국내에서 수집한 trichoderma 7종에 대하여 유연관계 를 조사한 결과 크게 4개의 그룹으로 나타났고, 수집균주 별로 후막포자가 생성되는 것을 확인하였다. 대치배양 결과 모든 trichoderma종들이 Fusarium wilt에 대하여 억제하는 효과를 보였다. 시험관테스트서 다른 균주들에 비해 J9, J10, J13, J16균주들의 침입력이 높았고, 포자 생성량도 많았다. 알루미늄링 테스트에서는 J9, J10, J13 에서 포자의 생성량이 다른 균주 보다 많은 것으로 나타 났다. 오이에 대한 포트검정을 실시한 결과 초장은 J13에 서 대조구 보다 크게 나타났고, 근장은 J2를 제외한 모든 균주에서 대조구 보다 길었으며, 근중은 J1, J9, J10, J13, J16이 대조 보다 많았다. Fusarium wilt에 대한 발 병도는 대조구 대비 J13과 J16에서 가장 작았으며, 방제 가는 J13과 J16에서 다른 균주들에 비해 높게 나타났다.

    감사의 글

    본 연구는 2017년도 중소벤처기업부의 기술개발사업 지원에 의한 연구임 [C0513579].

    Figure

    JESI-28-3-385_F1.gif

    Phylogenetic dendrogram generated from analysis of ITS rDNA sequence of Trichoderma spp.

    JESI-28-3-385_F2.gif

    Morphological features of hyphae containing chlamydospores. ×400. A: J1, B: J2, C: J9, D: J10, E: J13, F: J16, G: J17.

    JESI-28-3-385_F3.gif

    Hyperparasitical activity of Trichoderma sp. against wilt disease by dual culture method. Left: Fusarium wilt, Right: Trichoderma sp.. A: Fusarium wilt, B: J1, C: J2, D: J9, E: J10, F: J13, G: J16, H: J17.

    JESI-28-3-385_F4.gif

    Dual cultures of Trichoderma species and Fusarium wilt on substrate at 25 °C. Left: Trichoderma sp., Right: Fusarium wilt. A: Fusarium wilt, B: J1, C: J2, D: J9, E: J10, F: J13, G: J16, H: J17.

    JESI-28-3-385_F5.gif

    Antibiotic effect of Trichoderma spp. on Fusarium wilt. A: Fusarium wilt, B: J1, C: J2, D: J9, E: J10, F: J13, G: J16, H: J17.

    JESI-28-3-385_F6.gif

    Root form of cucumbers during treating 7 kinds of trichoderma for Fusarium wilt. A: Fusarium wilt, B: J1, C: J2, D: J9, E: J10, F: J13, G: J16, H: J17.

    Table

    Source and geographic origin of fungi in this study

    Growth characteristics, disease severity, and control value according to port test of cucumbers

    Reference

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