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ISSN : 1225-4517(Print)
ISSN : 2287-3503(Online)
Journal of Environmental Science International Vol.28 No.11 pp.943-950
DOI : https://doi.org/10.5322/JESI.2019.28.11.943

Influences of Sodium Fluoride Contents on Hepatic Functional Enzyme Activities in Rats

Han-Soo Kim*
Department of Food Science and Technology, Pusan National University, Miryang 50463, Korea
Corresponding author: Han-Soo Kim, Department of Food Science and Technology, Pusan National University, Miryang 50463, Korea Phone: +82-55-350-5351 E-mail : kimhs777@pusan.ac.kr
01/09/2019 01/10/2019 04/10/2019

Abstract


The purpose of this study was to probe the influences of NaF oral administration on a dose-effect relationship between fluoride levels of serum enzyme activity such as alkaline phosphatase (ALP), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), and lactate dehydrogenase (LDH) in rats fed experimental diets for 5 weeks. All groups increased the activity of serum ALP, AST, ALT, and LDH levels with increasing NaF. In addition the fluoride levels of serum and organ tissues (liver, brain, heart, lung, kidney) in oral NaF groups (NF3~NF50) were significantly increased by adding sodium fluoride in comparison with normal diet group (ND) (p<0.05). These results, a high concentration of sodium fluoride was determined that the toxicity to various organ tissues.



Sodium Fluoride 함량이 흰쥐의 간 기능 효소활성에 미치는 영향

김 한수*
부산대학교 식품공학과
    Pusan National University

    1. 서 론

    불소는 전기음성도가 크게 반응하는 물질로 자연에서 는 원소 상태로 발견하기가 어렵다(Gillespie et al., 1989). 때문에 무기물이나 유기물의 화합물 상태로 존재 하며, 무기물로 존재하는 불소화합물은 주로 플루오린화 나트륨(NaF), 모노플루오르인산나트륨(Na2PO3F), 플루오 르화주석(II)(SnF2)의 형태로 식품 가공, 치약의 형태로 일상에 많이 사용되고 있다(Whitford, 1994). NaF는 식 수에 불소 이온을 공급하기 위해 사용되었으나 신경 계 통을 자극하는 독성이 있어 hexafluorosilicic acid (H2SiF6)나 sodium hexafluorosilicate (Na2SiF6)으로 대체되었으며(Urbansky, 2002;Pollick, 2013), 치약에 는 충치를 예방하기 위해 NaF를 첨가하기도 한다. 그러 나 적절한 양(0.8~1.2 ppm)일 때는 충치예방과 변색방 지 등의 장점이 있지만 매일 일정량 이상 장기간 섭취한 다면 신경조직에 독성을 나타내어 뇌 발달에 영향을 준 다(Mittal and Flora, 2006). 또한, 간 및 신장, 척수 등 동물과 인간의 기관, 주로 골격 시스템에 많은 손상을 야 기한다고 보고되어 있다(Dote at al., 2000;Wang et al., 2004). 또한 식수의 소독에 사용하는 불소의 농도는 0.7~1.2 mg/L를 유지하는 것이 효과적이고 안전하다고 알려져 있다(US Public Health Service, 1991). 불소와 골경화증, 호흡기 질환 사이의 관계가 아직 명확히 규명 되지 않았다는 것으로 보고되어 있다(Mullenix et al., 1995). 또한 일정 이상 농도의 불소에 장기간 노출되었 을 때 체내의 여러 산화적 스트레스를 유발하여 혈중 포 화지방산/불포화지방산 비율 증가 및 테스토스테론 (testosterone)의 농도를 감소시키고 간장과 신장, 남성 생식 기관에 악영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Wang et al., 2000;Ghosh et al., 2002;Xiong et al., 2007). Gessner et al.(1994)는 불소농도 150 mg/L 가량의 물 을 식수로 사용하여 급성 중독을 일으킨 296명의 환자에 게서 메스꺼움, 구토, 설사, 복통과 감각 이상의 증상이 나타났으며, 1명은 사망하였다고 보고하였다. 또한, NaF 의 인체내 독성은 1 g 미만 섭취에 의해서도 심각한 증상 을 보이며, 흰쥐에 있어서 경구투여로 인한 LD50이 0.18 g/kg으로 보고되어 있다(Merck index, 1983).이에 본 연구는 krill에 함유된 고농도 불소 양에 대한 식품으 로서의 안전한 활용 가능성을 모색하기 위한 임상적 특 성과 불소 기준치 및 기준 규격 설정을 위한 과제로, NaF 농도에 따라 흰쥐의 장기에서 축적된 NaF 함량 및 혈청 효소활성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 실험을 수행하였다.

    2. 재료 및 방법

    2.1. 실험재료

    본 실험에 사용된 sodium fluoride (NaF) 시약은 Sigma Adrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에 서 구입하였으며, 그 외에 실험에 사용된 분석용 kit 시약 은 Eiken (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다.

    2.2. 실험 동물

    평균 체중 200±10 g인 7주령된 Sprague Dawley계 수컷 흰쥐(DAEHAN BIOLINK Co., LTD, Eumseong, Korea)를 7% 콩기름(Ottogi, soybean oil, Anyang, Korea)을 함유하는 기초식이로 1주일간 예비사육하여 적응시킨 후 난괴법(randomized complete block design)에 의해 6마리씩 9군으로 metabolic cage (JD-C-71, Jeongdo, Korea)에 나누어 5주간 실험사육 하였다. 실험 사육실의 온도 20±1℃ 및 습도 50±10%는 일정하게 유지시켰고, 명암은 12시간(7:00~19:00) 주기 로 조명하였다(Kim et al., 2014). 예비사육 및 실험사육 등 동물실험은 부산대학교 동물실험윤리위원회 승인 (PNU-2012-0004)과 관리 감독 하에 실시되었다.

    2.3. 식이조성 및 실험군

    식이조성 및 실험군은 Table 1과 같다. 기본식이를 섭 취시킨 대조군(ND)과 기본식이에 NaF를 용량별로 경구 투여한 NF3, NF5, NF10, NF15, NF20, NF25, NF30, NF50군으로 나누었다.

    2.4. 실험 동물의 처리

    실험사육 최종일에 7시간 동안 절식시킨 후, 가스마취 기(animal inhalation narcosis control, SK-INC-100A, Daejong, Seoul, Korea)를 사용하여 CO2 gas 마취하에 심장채혈법으로 혈액을 취하여 4℃에서 1시간 방치한 다 음, 분당 3,000 cycle로 20분간 원심분리하여 혈청을 얻 어 실험에 사용하였다(Kim et al., 2014).

    2.5. 효소 활성의 측정

    2.5.1. Alkaline phosphatase (ALP) 활성

    혈청 중 alkaline phosphatase (ALP, EC 3.1.3.1) 활 성은 혈청 ALP측정용 kit 시약(NEW-K-PHOS, Eiken, Tokyo, Japan)을 이용하여 생화학분석기(Hitachi 7150, Tokyo, Japan)로 측정하였으며, 혈청 1.0 mL당 unit으 로 표시하였다.

    2.5.2. Aminotransferase (AST, ALT) 활성

    Aspartate aminotransferase (AST, EC 2.6.1.1)와 alanine aminotransferase (ALT, EC 2.6.1.2)는 효소법 에 의해 조제된 시약(혈청 transaminase 측정시약, Eiken, Tokyo, Japan)을 사용하여 혈청 중 AST 및 ALT활성을 측정하였으며 혈청 1.0 mL당 unit으로 표시하였다.

    2.5.3. Lactate dehydrogenase (LDH) 활성

    Lactate dehydrogenase (LDH, EC 1.1.1.27)는 효소 법에 의해 조제된 kit시약(Eiken, Tokyo, Japan)을 사용 하여 생화학분석기(Hitachi 7150, Tokyo, Japan)로 측 정하였다(Kim, 2006).

    2.6. 불소(F) 함량의 측정

    총 불소 함량은 Singer and Ophaug(1979)의 방법에 준하여 측정하였다. 시료를 nickel 도가니에 칭량한 다 음, 0.5 M의 NaOH 용액을 2.0 mL 주입하여 혼합한 후 도가니를 hot plate 위에 놓고 증발, 건조시킨 뒤 550℃ 에서 5시간 동안 연소시켰다. 도가니를 냉각한 다음, 증 류수 7.0 mL 가하여 시료 용액을 15.0 mL conical tube 에 옮기고 pH를 1.2 mol HCl 용액으로 pH 7.5까지 조 절한 후 10.0 mL에 정용하였다. 이 중 2.0 mL를 취하여 TISAB Ⅲ (total ionic strenght adjust buffer Ⅲ) 용액 0.2 mL 가한 후 완전히 혼합하여 불소이온전극(9609 BNWP and 960900 fluoride combination electrode, Thermo Scientific, U.S.A.)을 pH/mv 메타(Orion dual star, pH/ISE benchtop, Thermo Scientific, U.S.A.)와 연결하여 측정하였다. 시료의 불소 함량은 불소 이온의 sodium fluoride 표준검량곡선에 의하여 정량(Jin et al., 2018)하였다.

    2.7. 통계 처리

    분석 결과의 통계처리는 실험군 당 평균치의 표준편 차를 계산하였고, 군간의 유의적인 차이는 one-way ANOVA로 분석 한 뒤 p<0.05 수준에서 Duncan`s multiple range test에 의하여 각 실험군 간의 유의성을 검정하였다. 통계처리에 대한 프로그램은 IBM SPSS statistic ver. 22를 사용하였다.

    3. 결과 및 고찰

    3.1. Alkaline phosphatase (ALP) 활성

    실험에 사용된 흰쥐 혈청에서의 alkaline phosphatase (ALP, EC 3.1.3.1) 활성은 Fig. 1과 같다. NaF 경구 투 여군인 NF3~NF50군에서의 ALP활성은 28.5~37.9 unit/mL으로 나타났으며, 기본식이를 급여한 대조군인 ND군의 ALP 활성 27.8±1.1 unit/mL 보다 NF3군과 NF5군을 제외하고 유의적인 차이를 보이며 높게 나타났 다(p<0.05). 또한 투여한 NaF 농도가 증가함에 따라 ALP 활성이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. ALP는 간세포의 담관에 존재하는 효소로서 이상지질혈증이나 담즙산 배설 장애 등에 의한 간 세포 손상 시 그 수치가 증가하여 만성 감염, 간 경변 등의 간 기능 검사의 지표로 사용 된다고 알려져 있다(Kaplan and Righetti, 1970;Ooi et al., 2007). 또한 골 형성을 자극하여 골절, 성장 등의 이유로 조골세포(osteoblast)를 합성할 때 ALP 활 성이 증가한다고 알려져 있다(Wergedal and Baylink, 1983;Anderson et al., 2004;Eune et al., 2005). Krook and Minor(1998)의 연구에서는 불소를 이용한 골다공증 치료에서 불소는 강력한 효소 독으로 작용하여 불소에 의한 세포 손상으로 인해 ALP 활성이 증가하였 다고 보고하였다. 이에 본 실험 결과 또한 흰쥐에게 경구 투여한 불소에 의한 독성으로 ALP 활성이 증가하였다고 판단되며 NaF 농도에 따른 ALP 활성 증가를 관찰할 수 있었 다.

    3.2. Aminotransferase (AST, ALT) 활성

    흰쥐 혈청 중의 aspartate aminotransferase (AST, EC 2.6.1.1) 및 alanine aminotransferase (ALT, EC 2.6.1.2) 활성은 Fig. 2에 나타내었다. ND군과 NaF 경 구 투여군(NF3~NF50)에서의 AST 및 ALT 활성은 NaF 투여한 농도가 증가할수록 활성이 증가하는 경향 으로 나타났으며, 대조군인 ND군의 AST 및 ALT 활성 은 각각 68.5±1.9 unit/mL, 23.8±1.2 unit/mL으로 가장 낮은 활성이 관찰되었다. 대조군인 ND군과의 유의적인 차이는 AST 활성에서 NF5군 이상에서 나타났으며, ALT 활성에서는 NF10군부터 나타났다(p<0.05). NF50 군에서 AST 활성이 78.2±1.2 unit/mL, ALT 활성 34.7±1.2 unit/mL로 가장 높은 활성이 관찰되었다. AST 및 ALT는 간, 심장, 신장, 뇌 등에 존재하는 효소로 주로 알코올성 간염, 지방간, 간 세포 손상 등 세포독성에 의해 활성이 증가하며(Clark et al., 2003;Kim et al., 2004), Vozarova et al.(2002)의 연구에서 높은 ALT 활 성은 제 2형 당뇨병 위험의 바이오마커가 될 수 있으며 간 기능 저하는 당뇨병 발병 기전의 잠재적인 역할을 한 다고 보고하였다. Zabulyte et al.(2007)은 흰쥐에게 90 일 간 NaF 10 mg/kg을 노출한 뒤 혈액 및 조직학적 검 사를 통해 AST 및 ALT 활성 상승 및 신장 기능 장애가 발생한 것을 발견하였다고 한다. 이에 본 실험 결과 NaF 경구 투여 시 AST, ALT 활성이 증가하는 것으로 보아 불소는 간세포에 대한 독성이 있으며, 나아가 당뇨병 등 생활습관병의 잠재적 위험이 될 수 있는 것으로 판단된 다.

    3.3. Lactate dehydrogenase (LDH) 활성

    흰쥐 혈청 중 lactate dehydrogenase (LDH, EC 1.1.1.27) 활성은 Fig. 3에 나타내었다. 대조군인 ND군 에서의 LDH 활성은 934.2±18.2 unit/mL으로 NF3군 (955.6±18.1 unit/mL)과 NF5(959.8±17.8 unit/mL)군 을 제외한 다른 군에 비해 유의적으로 낮게 관찰 되었으 며(p<0.05), NF10군(977.3±18.9 unit/mL)부터 LDH 활성은 경구 투여한 NaF 농도가 증가함에 따라 LDH 활 성 또한 증가하여 NF50군(1057.3±22.4 unit/mL)에서 유의적으로 가장 높은 활성이 관찰되었다(p<0.05). LDH 활성은 이상지질혈증의 발생과 지방간으로 인한 담즙 분 비 장애에 의한 것으로 알려져 있다(Kim, 1980;Kim, 2006). 또한 종양세포, 간세포와 같이 LDH를 내포한 조직이 파괴될 때 LDH를 혈액 중으로 방출하여 세포독 성 및 Tumor Necrosis Factor (TNF)의 활성에 LDH 수 치가 이용되는 것으로 보고되어 있다(Decker and Lohmann-Matthes, 1988). 간 손상의 정도는 ALP, AST, ALT 및 LDH 등 여러 효소를 간 손상 지표로 사 용되며(Wu et al., 2004), 그 중 LDH는 혈액에서의 질 소 산화물 저항, 지속발기증, 다리 궤양, 폐 고혈압, 겸상 적혈구 빈혈과 같은 바이오 마커로 사용될 수 있다고 보 고되고 있다(Kato et al., 2006). Chan et al.(2013)의 연 구에서는 세포 내 효소 LDH의 방출을 측정함으로써 단 계적인 세포괴사 검출의 유용한 방법을 제시하였다. 이 에 본 연구에서 NaF를 투여함에 따라 LDH 활성이 증가 하는 것으로 보아 NaF가 세포 독성을 나타내는 것으로 사료된다.

    3.4. 혈청 및 장기조직의 불소 함량

    불소 함량 계산에 사용된 검량선은 Fig. 4에 표시하였 으며(Jin et al., 2018), 흰쥐의 혈청 및 장기조직의 불소 함량은 Table 2에 나타내었다. 혈청 중 불소함량은 대조 군인 ND군과 비교하였을 때 NF3군과 NF5군에서 유의 적인 차이는 관찰되지 않았으나, NF10군부터 유의적 차 이를 보이며 NaF 농도에 따라 불소 함량이 증가하였다 (p<0.05). 간장, 뇌, 심장, 폐, 신장에서의 불소함량은 모 든 NaF 경구 투여군에서 ND군에 비해 NaF 투여 농도 에 따라 유의적으로 증가하였으며(p<0.05), 혈청을 포함 한 모든 장기에서의 불소 함량은 NF50군에서 가장 높게 관찰되었다. 대조군인 ND군과 50 mg의 NaF를 경구 투 여한 NF50군의 불소함량을 비교하였을 때 혈청 2.4배, 간 3.1배, 뇌 1.8배, 심장 4.5배, 폐 3.5배, 신장 2.7배 증 가하였으며, 이에 혈청 및 장기 조직에 불소가 축적되는 정도 차이가 있는 것으로 판단된다. NaF는 항산화 효소 인 glutathione peroxidase, surperoxide dismutase, catalase 등의 활동뿐만 아니라, 여러 장기의 항산화 활 성 저해와 지질 과산화 수준의 상승을 일으키는 원인이 며 독성으로 인한 조직학적 변화를 일으키는 것으로 보 고되고 있다(Manivannan et al., 2013;Hamza et al., 2015). 또한 불소 노출이 장기적으로 지속되면 골격 불 소증(skeletal fluorosis)이 진행과 함께 골세포 미네랄 대 사의 항상성에 영향을 주어 뼈의 기형, 척추 압박, 관절 움 직임의 제한이 발생한다고 알려져 있다(Krishnamachari, 1985;Reddy et al., 2003). 이에 장기간의 불소 노출은 여러 장기에 축적되는 것으로 관찰되었으며, 이는 골격 과 장기 기능의 손상을 초래하는 것으로 판단된다.

    4. 결 론

    7주령된 Sprague Dawley계 수컷 흰쥐에게 5주간의 농도별 NaF 경구 투여가 혈청 효소활성과 혈청 및 장기 조직의 불소 함량에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 본 실험을 실시하였다. 대조군인 ND군과 NaF 경구 투여처 리 군(NF3~NF50) 9가지 군으로 나누어 사육하였으며, 혈청 중 alkaline phosphatase (ALP), aminotransferase (AST, ALT), lactate dehydrogenase (LDH)의 효소 활 성은 NaF 경구 투여 군에서 NaF 투여 농도 증가에 따라 활성이 증가하였으며, 고농도의 NaF 경구 처리 군에서 대조군인 ND군보다 유의적인 차이를 나타내며 증가하 였다(p<0.05). 흰쥐의 혈청 및 장기조직의 불소 함량 또 한 NaF 투여 농도에 따라 불소 함량도 함께 증가하는 것 으로 나타났다. 이와 같은 결과들을 미루어 볼 때, NaF 경구 투여는 농도의 증가에 따라 혈청 및 장기조직에 불 소 축적 및 ALP, AST, ALT, LDH 효소활성을 증가시 키는 것으로 관찰되어 여러 장기 조직에 독성을 유발하 여 악영향을 미치는 것으로 나타났으며, 경구 섭취에 의 한 실험동물의 LD50 및 치사량 등의 검토가 시급한 것으 로 판단된다.

    감사의 글

    본 연구는 부산대학교 기본연구지원사업(2년) 지원에 의하여 수행되었습니다.

    Figure

    JESI-28-11-943_F1.gif

    Effects of sodium fluoride on alkaline phosphatase (ALP, EC 3.1.3.1) activities in serum of experimental rats.

    1)The values are means±standard deviation (n=6). Bars with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan`s multiple range tests.

    JESI-28-11-943_F2.gif

    Effects of sodium fluoride on aspartate and alanine aminotransferase (AST, EC 2.6.1.1 ; ALT, EC 2.6.1.2) activities in serum of experimental rats.

    1)The values are means±standard deviation (n=6). Bars with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan`s multiple range tests.

    JESI-28-11-943_F3.gif

    Effects of sodium fluoride on lactate dehydrogenase activity in serum of rats fed the experimental diets for 5 weeks.

    1)The values are means±standard deviation (n=6). Bars with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan`s multiple range tests.

    JESI-28-11-943_F4.gif

    Standard curve of fluoride standard solution.

    Table

    Compositions of experimental diet and groups (%)

    Determination of fluoride (F) contents in serum and tissue of the rats fed experimental diet for 5 weeks

    Reference

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